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    基因合成方法及產(chǎn)業(yè)現狀介紹

    發(fā)布時(shí)間:2021/12/27      點(diǎn)擊次數:1240
     基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)?;蚝铣墒怯萌斯し椒ê铣苫虻募夹g(shù),是基因獲取的手段之一,相對于從已有生物中獲取基因來(lái)說(shuō),基因合成無(wú)需模板,因而不受基因來(lái)源限制。

     

    什么是基因合成

     

    基因合成是依照某一蛋白質(zhì)的基因序列,設計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸,再通過(guò)重疊延伸PCR法拼接出全長(cháng),基因合成無(wú)需模板,是獲取基因的手段之一以提高在異源宿主的表達量行全基因合成,目前該技術(shù)主要應用在基因的異源表達上,對基因密碼子優(yōu)化后進(jìn)。

     

    此外,基因合成技術(shù)還用于合成一些不易獲取模板的基因或者自然界不存在的新基因等?;蚝铣杉夹g(shù)可以按照人們的意愿設計且靈活地合成,正好符合了當代生物學(xué)發(fā)展的潮流,將會(huì )在越來(lái)越多的領(lǐng)域得到應用,并且發(fā)揮巨大的作用。

     

    基因合成的方法主要有組裝PCR重疊延伸PCR、TBIO法、PTDS法等。困擾全基因合成技術(shù)的問(wèn)題主要有2個(gè):①合成基因中堿基錯誤率高。②合成成本高。

     

    在基因合成前,為使基因在不同生物表達體系中都能得到良好表達,研究人員通常會(huì )對基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。遺傳密碼有64種,但是絕大多數生物傾向于利用這些???碼子中的一部分,那些被最頻繁利用的稱(chēng)為最佳密碼子,那些不被經(jīng)常利用的稱(chēng)為稀有或利用率低的密碼子。

     

    實(shí)際上用做蛋白表達或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌,酵母,哺乳動(dòng)物細胞,植物細胞和昆蟲(chóng)細胞)都表現出某種程度的密碼子偏愛(ài)性,因此,重組蛋白的表達可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達系統中)。

     

    在不改變其編碼蛋白的情況下,對一個(gè)蛋白的編碼基因進(jìn)行改變,去除稀有密碼子,合理優(yōu)化其mRNA二級結構,GC含量等的過(guò)程叫密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的原理即根據將要使用的表達系統的密碼子偏愛(ài)性,針對目標蛋白序列中的每一個(gè)氨基酸選擇不同的密碼子進(jìn)行全序列的組合,找出其中*的一條。

     

    1、引物合成

     

    研究人員根據自己的意愿確定合成的基因序列后,由于沒(méi)有模板,首先需根據待合成的雙鏈DNA設計引物、合成引物。引物,又名引子,是一小段單鏈DNA或RNA,作為DNA復制的起始點(diǎn),在核酸合成反應時(shí),作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈。

     

    在PCR(聚合酶鏈式反應)技術(shù)中,已知一段目的基因核苷酸序列,根據這一序列合成引物,利用PCR擴增技術(shù),目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈,引物與單鏈相應互補序列結合,然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸,如此重復循環(huán),延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結合。

     

    簡(jiǎn)單地說(shuō),引物即是短的單鏈DNA或短的RNA鏈,序列長(cháng)度一般為15~90nt(nt為引物堿基單位,有些也用nt或bp標識),一般不超過(guò)120nt。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩定的特點(diǎn)。亞磷酰胺三酯法是將DNA偶聯(lián)在固相載體上完成DNA鏈的合成的,引物合成的方向依據既定引物序列由3'端向5'端延伸,相鄰的核苷酸通過(guò)3'→5'磷酸二酯鍵連接。

     

    2、引物互為模板PCR擴增

     

    引物合成后,引物之間互為模板進(jìn)行PCR擴增。PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復制過(guò)程,其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

     

    PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應步驟構成:

     

    ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;

     

    ②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

     

    ③引物的延伸:DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

     

    重復循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。

     

     

    3、連接轉化、菌檢送測

     

    通過(guò)PCR反應,可擴增出我們需要的雙鏈DNA。但PCR產(chǎn)物穩定性較低,我們需將連接到質(zhì)粒上,轉化進(jìn)感受態(tài)中,涂平板過(guò)夜培養。第二天早上就可以從平板中挑選陽(yáng)性克隆,挑到的克隆需要再次使用菌落PCR驗證是否有全長(cháng)的基因插入,使用首尾引物進(jìn)行PCR,如果有產(chǎn)物,說(shuō)明有目的基因。將驗證過(guò)的克隆轉化進(jìn)入試管培養搖菌,之后,抽提質(zhì)粒,純化送去進(jìn)行測序。

     

    4、一代測序

     

    目前,我們采用的是一代測序,也叫sanger測序。Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結合在待定序列模板上的引物,直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個(gè)單獨的反應構成,每個(gè)反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。

     

    由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團,使延長(cháng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整,使反應得到一組長(cháng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。

     

    它們具有共同的起始點(diǎn),但終止在不同的核苷酸上,可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段,凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進(jìn)行檢測。

     

    5、QC驗證

     

    將測序結果與目標基因進(jìn)行比對,同時(shí)進(jìn)行QC酶切驗證,如果測序結果與酶切驗證結果均正確,就完成目的基因的合成了。按照上述步驟,順利的情況下5天時(shí)間就能合成出一段800bp左右的基因序列。

     

    目前,基因合成周期短,同時(shí)可以保證序列的100%正確無(wú)誤,具有很大的靈活性,可以對基因的酶切位點(diǎn)和基因序列進(jìn)行修改,方便下游的克隆和實(shí)驗;研究人員根據自己的意愿設計得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因;基因合成的基因可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化,使基因在各種生物表達體系中都能得到良好表達。

     

    這些優(yōu)點(diǎn)使得基因合成在生物領(lǐng)域有著(zhù)廣泛應用,比如克隆人鼠抗體或重組抗體、合成不同的基因突變株、SNPS或其他突變株、設計合成DNA疫苗、大量合成用于微芯片的cDNA等?;蚝铣杉夹g(shù)的發(fā)展使生物領(lǐng)域又上了一個(gè)新臺階。

     

    基因合成產(chǎn)業(yè)

     

    美國基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)達,有賴(lài)于發(fā)達的生物產(chǎn)業(yè),政府與企業(yè)在基因業(yè)務(wù)上投入比較大,而國內大批量投入的科研產(chǎn)業(yè)少,基因合成市場(chǎng)有限,客戶(hù)主要是科研單位。未來(lái)中國的基因合成產(chǎn)業(yè),很大程度上受到國家對生物產(chǎn)業(yè)的政策引導的影響。

     

    國外分析機構的數據顯示,2014年全球包括工業(yè)級和科研級在內的合成基因市場(chǎng)規模為20億美元,其中中國1.2億美元,僅占6%。這個(gè)小數據表明,國內生物產(chǎn)業(yè)自己研發(fā)的東西太少,大部分國內生物制藥企業(yè),還是持續依靠復制國外技術(shù),甚至等技術(shù)過(guò)期后直接拿來(lái)用,這樣并不需要合成基因。

     

    因為合成基因只有在前期研發(fā)的時(shí)候才有較大的應用空間,如果研發(fā)投入少,基因合成出來(lái)沒(méi)有消耗的市場(chǎng),投入相應就會(huì )小很多。國內生物制藥企業(yè)長(cháng)期只是模仿,路會(huì )越走越窄,發(fā)展到一定程度就會(huì )遇到很大的瓶頸。

     

     

    從另一方面看,各國的生物產(chǎn)業(yè)都受到一定的限制,這是由行業(yè)特征決定的:生物產(chǎn)業(yè)是一個(gè)長(cháng)期投入、高投入、成功率不高的產(chǎn)業(yè),不像其他行業(yè)那樣能更快地產(chǎn)業(yè)化。

     

    經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展,整個(gè)基因合成行業(yè)已經(jīng)很成熟,然而,也引發(fā)了一系列行業(yè)問(wèn)題。由于進(jìn)入門(mén)檻低、競爭無(wú)序,國內企業(yè)不得不憑借國內人力成本低的優(yōu)勢,趨向到國外接單、國內合成的業(yè)務(wù)。

     

    基因合成入行門(mén)檻不高,一些小的公司買(mǎi)一臺儀器,三四個(gè)人就可以從事這項工作,一個(gè)人去跑市場(chǎng),攢夠訂單后就能開(kāi)機。

     

    基因合成行業(yè)拼的主要是儀器的通量。企業(yè)開(kāi)機一次合成低于1000條BP是虧錢(qián)的,大規模、大通量才可以降低成本。

     

    擠入這個(gè)行業(yè)者眾多,但基因合成技術(shù)還處于1.0版本,合成能力有限、合成周期較長(cháng)、通量不高,因此,成本高。合成價(jià)格對于需求方而言仍然昂貴,也是國內基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的主因之一。

    基因合成儀 


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